HFE-Mutationsanalytik

Die HFE-Analytik wird z.Zt. in Deutschland von vielen Labors angeboten, sicher auch in Ihrer Nähe (z.B. Klinische Chemie einer UniKlinik, große Laborgemeinschaft). 

Literatur (s. Artikel aus Deutschem Ärzteblatt als pdf-File)

 Molekularbiologische Grundlagen

In einer sehr aufwendigen Suchaktion wurde 1996 von der amerikanischen Firma Mercator Genetics, die eigens zu diesem Zweck gegründet wurde, das wahrscheinliche Hämochromatose-Gen (HFE) mittels „positional cloning" lokalisiert und die für die Krankheit ursächliche Punktmutation identifiziert (Feder et al. 1996, 1997, 1998). 

In dem HFE-Gen von Patienten mit Hämochromatose wurde eine Punktmutation gefunden, bei der eine Transition von Guanin 845 nach Adenin vorliegt. Dies führt im korrespondierenden Polypeptid zu einem Aminosäureaustausch Cystein 282 nach Tyrosin (Cys282Tyr bzw. C282Y). Die Primärstruktur des zugehörigen Proteins ähnelt sehr dem Antigen-präsentierenden HLA-A-Protein, zeigt aber nicht dessen Polymorphismus. Von der Primärstruktur kann abgeleitet werden, dass das HFE-Protein ß₂-Mikroglobulin nichtkovalent bindet. Offenbar wird durch diese Mutation die Bindung von ß2-Mikroglobulin an das HFE-Genprodukt blockiert (Feder et al. 1996, Lebron et al. 1998). Dies passt sehr gut zu der Beobachtung, daß für ß2-Mikroglobulin defiziente Mäuse spontan eine hämochromatose-ähnliche Eisenüberladung entwickeln (DeSousa et al. 1994, Rothenberg und Voland 1996, Santos et al. 1997). Inzwischen gibt es auch eine HFE-Gen „knockout"-Maus, die bezüglich gesteigerter intestinaler Eisenaufnahme und parenchymale Eisenüberladung genau der hereditären Hämochromatose beim Menschen entspricht (Zhou et al. 1998).

Der erste Hinweis auf die direkte Verknüpfung des HFE Gen mit dem Eisenstoffwechsel ergab sich durch die Beobachtung, daß das HFE-Protein mit dem Transferrin Rezeptor einen Komplex bildet und offenbar die Affinität des TfR zu Transferrin herabsetzt. Das C282Y-mutierte Protein zeigt diese Bindung und Wirkung nicht (Feder et al. 1996, Lebron et al. 1998).

Eine zweite Mutation im HFE-Gen, Histidin 63 =>Asparaginsäure (H63D) kommt zu ca. 15 % in der Normalbevölkerung vor, offenbar aber nicht zusammen mit der C282Y Mutation in einem Allel (Feder et al. 1996). Bei Personen mit klinischem Verdacht auf hereditäre Hämochromatose findet man in einigen Studien signifikant häufiger heterozygote Gen-Träger für die C282Y-Mutation die auch heterozygot für die H63D Mutation sind. Möglicherweise führt diese „Compound"-Heterozygotie ebenfalls zu einer klinisch relevanten Eisenüberladung (Feder et al. 1996). Es bleibt abzuwarten, ob die H63D-Mutation im Rahmen der erblichen Eisenspeicherkrankheit bzw. bei Lebererkrankungen mit evtl. begleitender leichter Eisenüberladung eine pathophysiologische Relevanz besitzt und damit auch langfristig eine diagnostische Bedeutung gewinnen wird.

Das HFE-Gen wird in allen Geweben exprimiert (Leber, Duodenum, Herz, Pankreas), die bei Hämochromatose eine Rolle spielen (Feder et al. 1996). 

Momentan ist unklar, was die physiologische Funktion von HFE beim Gesunden genau ist. Unklar ist auch, wie man sich die große Variabilität der individuellen Eisenspeicherung bei verschiedenen Patienten mit Hämochromatose erklären kann. Ob dies allein durch unterschiedliche äußere Faktoren (Nahrungs-Eisen-Angebot) erklärbar ist oder ob zusätzliche genetische Faktoren beteiligt sind, bleibt abzuwarten.

Genetik

Die hereditäre Hämochromatose eine häufige, wenn nicht die häufigste, genetisch bedingte Krankheit der kaukasischen Bevölkerung Nordeuropas, Amerikas, Australiens. Die Homozygoten-Frequenz (q²) ist ungefähr 1 auf 400 Personen in der Normalbevölkerung. Die Gen-Frequenz (q) ist 1:20, die Heterozygotenhäufigkeit (2pq, Hardy-Weinberg- Gleichgewicht) ist 1 auf 10 Normalpersonen (Powell 1994). Die Häufigkeit der erblichen Eisenspeicherkrankheit ist damit weit größer als die der Phenylketonurie, der zystischen Fibrose und der Muskeldystrophie zusammengenommen. Die Inzidenz der Hämochromatose ist z.B. in den USA größer als das Auftreten von AIDS. Die Genhäufigkeit legt nahe, dass die heterozygote Form einen Selektionsvorteil in der Evolution geboten haben könnte. Denkbar wäre, dass eine leicht positive Eisenbilanz bei Heterozygoten hilfreich gewesen sein mag während ausgedehnter Hungerphasen, bei häufigen Schwangerschaften oder bei verbesserter Abwehr gegen Infektionen.

In nicht-kaukasischen Bevölkerungen (Ur-Australier, Chinesen) ist die Häufigkeit deutlich geringer (Gen-Frequenz 0.38 %) (Cullen et al. 1998). In diesen Völkern ist die Hämochromatose-Mutation wahrscheinlich durch Vermischung mit Kaukasiern schon in früher Zeit eingewandert.

Durch Studien von Marcel Simon in Frankreich wurde deutlich, dass es sich bei der hereditären Hämochromatose um eine autosomal rezessiv vererbte Krankheit handelt (Simon et al. 1977). Dies ergab sich aus der Tatsache, dass eine starke Assoziation der Krankheit mit dem HLA-A3 Antigen auf Chromosom 6 besteht. 75 % der Hämochromatose-Patienten einer Serie waren A3 positiv gegenüber 25 % in der Kontrollgruppe. Innerhalb von Familien konnte durch die HLA-Typisierung (A und B-Lokus) die Vererbung des Hämochromatose-Gens genau verfolgt werden. Weitere Studien führten zu der Annahme, daß es sich bei der Hämochromatose um eine singulär aufgetretene Veränderung der DNA handeln muß. Das Ursprungs-Hämochromatose-Gen entstand wahrscheinlich in der Steinzeit auf einem Chromosom mit dem zufälligen HLA-Haplotyp A3 B7.

Durch seltene Rekombinationsereignisse ergibt sich heute bei einem Teil der Patienten die Situation, dass das Hämochromatose-Allel nicht mit A3 assoziiert ist, sondern mit anderen A-Antigenen. Deshalb ist die HLA-Typisierung in der Normalbevölkerung keine geeignete Screening-Methode auf die Hämochromatose. Man hat sogar versucht, den Ur-Patienten lokal einzugrenzen. Die wahrscheinlichste Annahme geht von einem keltischen Vorfahren in der Bretagne aus, und die Verbreitung der Krankheit in der kaukasischen Bevölkerung folgt der Keltenwanderung (Simon et al. 1980, Mercier et al. 1998).

Abb. 1 zeigt die autosomal rezessive Vererbung in einem typischen Fall, in dem beide Elternteile des Patienten heterozygote Genträger sind. Für jedes der Geschwister resultiert nach Mendelschem Erbgesetz eine Wahrscheinlichkeit von 25 %, ebenfalls homozygot betroffen zu sein. Mit 25 %iger Wahrscheinlichkeit ist ein Geschwisterteil reinerbig, zu 50 % ein heterozygoter Genträger.

Abb. 1: Typischer autosomal rezessiver Erbgang bei hereditärer Hämochromatose. Beide Elternteile sind heterozygote Genträger und asymptomatisch. Die Vererbung der Hämochromatose-Allele wird angezeigt durch die HLA-Hyplotypen oder neuerdings durch den C282Y-Genotyp.

Die für Familienuntersuchungen bis vor kurzer Zeit so wertvolle HLA-Typisierung wird zukünftig auch aus Kostengründen wohl ganz zugunsten der direkten HFE-Mutationsdiagnostik (C282Y-Mutation) aufgegeben werden.

Ein Beispiel einer „pseudo-autosomal" dominanten Vererbung zeigt die Familie in Abb. 2. Hier sind der Vater und beide Kinder in homozygoter Form betroffen. Diese Konstellation ist möglich, wenn die Mutter auch zufällig Genträger für die Hämochromatose ist, so dass in der Elterngeneration 3 von 4 Chromosomen mutiert sind. Bei der Heterozygotenhäufigkeit von ca. 1:10 in der Normalbevölkerung ist diese Möglichkeit nicht einmal so unwahrscheinlich, so dass eine entsprechende Familienuntersuchung nicht nur auf die leiblichen Geschwister, sondern auch auf Kinder bzw. Eltern auszurichten ist.

Abb. 2: „Pseudo-"autosomal dominante Vererbung der hereditären Hämochromatose in einer Familie, in der ein Elternteil Genträger (wie üblich) das andere Elternteil aber selbst homozygot betroffen ist. Für jedes Kind resultiert in diesem Fall eine Chance von 50 % homozygot (wie in dieser Familie beide Kinder) betroffen zu sein (Alter, Laborwerte jeweils bei Diagnosestellung)

Molekulare Diagnostik

Mit der Klonierung des HFE-Gens und der Identifizierung der zwei wichtigen Mutationen (C282Y und H63D) sind alle Informationen zur Durchführung einer molekularen Diagnostik allgemein verfügbar. Die cDNA von HFE ist in der Gensequenz-Datenbank (Genbank) des National Institute of Health (NIH) unter der Nummer U60319 abgelegt und über die Adresse des National Center for Biotechnology Information

Das Testsystem von Feder et al. ist evtl. in leicht vereinfachter Form von verschiedenen Autoren auch aus Deutschland verwendet worden (Arnold et al. 1998, Gottschalk et al. 1998). Nach der DNA-Isolierung aus Vollblut wird der Bereich um die betreffende Mutation durch Verwendung von spezifischen Primern mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und durch Restriktionsananalyse charakterisiert. Dabei müssen nicht unbedingt die in der Originalarbeit verwendeten Primer benutzt werden. Wir haben in unserem Labor seit April 1997 eine Methode im Einsatz, die auch in Labors einer portugiesischen (Porto et al. 1998) und schwedischen Arbeitsgruppe (Cardoso et al. 1998) verwendet wird. Inzwischen gibt es  kommerzielle Anbieter auf dem Deutschen Markt (z.B.Hain Diagnostika, Nehren), die eine PCR-Methode mit sogen. reverser Hybridisierung anbietet, bei der amplifizierte DNA des Patienten an spezifische Gensonden bindet, die an Nitrocellulosestreifen immobilisiert sind. Es bleibt abzuwarten, welche Methode sich langfristig durchsetzen wird. Dabei wird zukünftig auch die Patentfrage eine Rolle spielen (Fa. Mercator Genetics), die bei den „Haus-gemachten" Testsystemen noch nicht beachtet worden ist.

Prävalenz der HFE-Mutationen in einem Kollektiv von Hämochromatose-Patienten und Kontrollen aus Norddeutschland

Es wurde ein eigenes Kollektiv von unverwandten Patienten (n=104) aus dem Norddeutschen Raum untersucht, die vom klinischen, biochemischen und histopathologischen Standpunkt als homozygot eingestuft waren.

Homozygotie für die erbliche Eisenspeicherkrankheit wurde angenommen, wenn mindestens drei der folgenden Kriterien erfüllt waren:

a.) Serum-Ferritin > 300 µg/l ; b.) Transferrin-Fe-Sättigung > 62 %.; c.) Leber- Eisenkonzentration größer 1500 µg/g Leber, d.) hepatischer Eisenindex (Leber-Fe- Konz./Lebensalter) > 24 µg/g/Jahr, e.) mehr als 4 g Speichereisen mobilisierbar durch Aderlasstherapie.

Ausgehend von jedem Patienten wurde eine Familienuntersuchung der Verwandten 1. Grades angestrebt. Dabei wurden weitere 42 Personen auf die HFE-Mutationen analysiert. Zusätzlich wurden 157 erwachsene Kontrollpersonen aus dem Norddeutschen Raum untersucht ).

Patienten. In der Patientengruppe waren 94.2 % homozygot und 5,8 % heterozygot für die C282Y Mutation. Bezüglich Eisenbeladung war kein Unterschied zwischen diesen beiden Untergruppen erkennbar. In 196 Chromosomen der homozygoten Patienten wurde keine H63D Mutation gefunden. 4 von 6 Chromosomen der heterozygoten Patienten, die keine C282Y-Mutation aufwiesen (=H63D-Risikochromosomen), wiesen dagegen auch die H63D Mutation auf.

Abb.1 Typisches Bild einer PCR-Analyse mit Restriktionsenzymbehandlung auf die C282Y-Mutation. 2 und 4. Bande von links: heterozygote Genträger mit einer C282Y-Mutation (50 % der DNA wird geschnitten). Bande 3 und 7 Wildtyp (keine Reaktion). Bande 4 und 6, homozygote Träger der C282Y-Mutation

Familienmitglieder.

In dieser Gruppe fanden sich 14 Personen mit homozygoter und 16 mit heterozygoter C282Y Mutation. 6 von 35 Risiko-Chromosomen trugen die H63D Mutation, darunter waren 3 Personen mit kombinierter Heterozygotie. Im Vergleich mit heterozygoten C282Y-Trägern aus der Kontrollgruppe zeigten sich keinerlei Unterschiede in den Werten für Transferrin-Fe-Sättigung und Serum-Ferritin.

Kontrollgruppe. Es wurde keine Personen mit homozygoter C282Y Mutation gefunden. 15 von 314 Chromosomen trugen die C282Y-Mutation (Gen-Frequenz: 0.048). 40 von 299 Risiko-Chromosomen wiesen die H63D Mutation auf (Gen-Frequenz: 0.13). Zwei Personen (1.3 %) waren homozygot, 23.6 % heterozygot für die H63D-Mutation.

Die große Häufigkeit der C282Y-Mutation in homozygoter Form in norddeutschen Patienten stimmt gut mit den Ergebnissen aus anderen Untersuchungen von kaukasischen Bevölkerungen überein (Feder et al. 1996, Merryweather-Clarke et al. 1997, Jazwinska et al. 1996, Jouanolle et al. 1997, Cardoso et al. 1998). Eine aktuelle Studie aus Frankfurt kommt zu einer vergleichbar hohen Zahl von C282Y-Homozygoten in Deutschland (Gottschalk et al. 1998). In nicht-kaukasischer Bevölkerungen (Ur-Australier, Chinesen) ist die Häufigkeit sehr viel geringer (Allel-Frequenz 0.38 %) (Cullen et al. 1998) und die HFE-Mutationen sind wahrscheinlich durch Vermischung mit Kaukasiern schon in früher Zeit eingewandert.

In Südeuropäischen Ländern wie Frankreich (nur bestimmte Regionen!), Italien und Griechenland scheint die Prävalenz der C282Y-Mutation ebenfalls deutlich niedriger zu liegen (50-70 %) (Borot et al. 1997, Carella et al. 1997, Piperno et al. 1998). Dies könnte auf eine weitere Mutation hindeuten, die zu Eisenüberladung führt und nur in südeuropäischen Bevölkerungen vorkommt.

Ähnlich wie in anderen Studien wurde eine hohe Zahl von kombinierten-Heterozygoten (C282Y/H63D) in der Gruppe der eisenüberladenen Patienten gefunden (Feder et al. 1996). Die Ursache für die auch hier wieder bestätigte komplette „linkage disequilibrium" zwischen der C282Y und der H63D Mutation ist weiter unklar.

In der Kontrollgruppe von 157 unverwandten Personen fand sich kein Fall von Eisenüberladung und keine homozygote C282Y Mutation. 15 von 314 Chromosomen wiesen die C282Y Mutation auf, was einer Allel-Frequenz von 4.8 % entspricht. Unterstellt man, dass diese Mutation die einzig notwendige Ursache für hereditäre Hämochromatose ist, dann kann man aus dieser Zahl eine Prävalenz für homozygote Hämochromatose von 1: 440 errechnen. Dies ist in sehr guter Übereinstimmung mit einer von uns durchgeführten Screening-Studie in 2812 prospektiven Blutspendern in Hamburg, bei der 7 Probanden mit Eisenüberladung gefunden wurden (Prävalenz 1:402) (Nielsen et al. 1995a).

Vergleicht man die Werte für Transferrin-Sättigung und Serum-Ferritin zwischen heterozygoten Trägern der C282Y-Mutation aus der Familien- und der Kontrollgruppe, so ergeben sich keine signifikanten Unterschiede. 

Dies zeigt an, dass es offenbar keine Unterschiede zwischen den „erprobten" Hämochromatose-Genen aus der Familiengruppe und den „Zufalls"-Genen aus der Kontrollgruppe gibt. Dies ist ein Argument für die These, daß die C282Y-Mutation die einzige und hinreichend notwendige Ursache für die Hämochromatose ist. In Übereinstimmung mit anderen Untersuchungen zeigte sich in unserer Studie, dass es einige eisenüberladene Patienten gibt, die nicht homozygot für die C282Y-Mutation sind.

Bei der Abklärung von Probanden mit V.a. Eisenüberladung fanden sich insgesamt auch 12Probanden mit homozygoter H63D-Mutation. In allen diesen Fällen waren in der Vorgeschichte erhöhte Blutwerte (Serum-Eisen oder Serum-Ferritin) bekannt, was bei unserer Untersuchung teilweise bestätigt wurde.

In zwei der Fälle zeigte sich eine leichtgradige Eisenüberladung, die eingangs definierten Kriterien für eine hereditäre Hämochromatose waren aber nicht erfüllt. In der Literatur finden sich zwei Abstracts mit 4 bzw. 6 H63D-homozygoten Patienten, die mittelgradig eisenüberladen waren (Messerschmitt et al. 1998, Sham et al. 1998). Möglicherweise führt also auch diese Konstellation in Einzelfällen zu einer relevanten Eisenüberladung. Dies liefert ein weiteres Argument dafür, die H63D-Mutation in Verdachtsfällen auf hered. Hämochromatose immer mitzubestimmen.

Andererseits gibt es auch Patienten mit homozygoter C282Y-Mutation, die nur wenig oder nicht eisenüberladen sind. Diese Ausnahmen sprechen dafür, dass nichtgenetische Faktoren, wie z.B. die individuelle Ernährungsform oder Alkoholkonsum eine Rolle spielen (Crawford et al. 1998, Powell 1994).

Zusammenfassend bestätigt sich der hohe Stellenwert der HFE-Gendiagnostik in Probanden mit V.a. Eisenüberladung. Bei allen Probanden, die nicht homozygot für die C282Y-Mutation sind, sollte unbedingt auch die H63D-Mutation getestet werden. Insgesamt zeichnet sich aber auch ab, dass die Gendiagnostik in einigen Fällen nicht definitiv sein wird und allein die Diagnose einer hereditären Hämochromatose nicht erbringen kann. Für die Diagnose und die Behandlungsnotwendigkeit ist auch weiterhin der Nachweis einer klinisch relevanten Lebersiderose im Vergleich zum Lebensalter notwendig.

Literatur

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